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2025 06-16 IHC免疫组化操作步骤IHC实验流程：通常包括样本固定、包埋、切片、脱蜡水化、抗原修复、灭活、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色、复染、封片观察12个部分。一、样本固定目的：确保组织样本的质量和完整性，为后续的免疫染色打下坚实基础。操作步骤：1）取材：从动物或人体取得所需的组织样本。对于组织块，要确保其大小适中，不宜过大，以便于固定液能够充分渗透；2）初步处理：如果组织样本带有血液或其他体液，应... 2025 05-06 ELISA常见问题一、标准曲线拟合不良1.移液错误，这可能导致添加到ELISA样品孔中的试剂浓度不正确。特别是在使用多通道移液器时，确保移液器按照制造商的标准进行准确校准和使用非常重要。2.标准品原液降解。这可能是由于ELISA试剂盒储存不当所致；使用降解的标准品原液时，实际浓度比标示浓度低，产生的OD值可能会低于预期，假设依然按照其标示浓度来稀释，会导致标准曲线不准确。二、高背景1.由于洗... 2025 04-07 包涵体Inclusion Bodies做重组蛋白原核表达可能会遇到WB验证没有条带的情况，总的来说是因为真核蛋白质在细菌宿主中表达时经常会形成包涵体（Inclusion Bodies），包涵体是缺乏生物活性的错误折叠蛋白的不溶性聚集体，而包涵体中的错误折叠蛋白是无法被WB检测出来的。虽然真核细胞表达能够满足蛋白质翻译后修饰的需求并且保持蛋白活性，但是产量通常要低得多，这也是选择原核表达进行生... 2025 03-17 一、如何选择合适的二抗宿主二抗应直接针对一抗种属，而不是来自于与一抗相同的种属。建议考虑以下因素：1、种属来源和种属反应性2、特异性反应3、纯化方法4、交叉吸附5、多重检测能力6、抗体类型和亚型7、完整抗体还是抗体片段8、标记物9、生物素结合蛋白 二、选择哪种形式的二抗1、Whole(整个)IgG分子：此种抗体适用于多数情况。2、Fab片段：它们只有一个结合位点，一般用来封闭内源性免疫球蛋白... 2025 03-10 （一）一抗的考虑因素1、分析或者应用类型： 识别相同蛋白的不同抗体，由于识别位点不同，决定了不同的使用用途。2、靶标种属:检测样本的种属。为了准确识别蛋白，需要找到正确的相对应的靶标种属。3、样品的性质： 刺激宿主动物产生抗体的抗原物质种类繁多，包括全长的蛋白、蛋白片段、多肽、整个生物机体（例如细菌）或细胞。免疫原通常在说明书中会有显示。4、样品的物种：选择抗体的时候，首选和待检测样本同一物... 2025 03-03 WB样本处理及保存 一、细胞样本（1） 悬浮细胞1.把细胞及培养液一起收集到15ml或者50ml离心管中，1500rpm离心3min，弃去上清；2.加入PBS轻轻吹打，1500rpm离心3min，弃去上清；3.反复3次，弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用。（2）贴壁细胞1.胰酶消化：用胰酶将细胞消化后，收集到15ml或者50ml离心管中，1500rpm离心3min，弃去上清；2.加入PBS... 2025 02-24 蛋白电泳的样品制备环节涵盖了多个关键步骤，其中包括从细胞基质当中有效地提取出蛋白样品，并使其充分溶解，同时还要对可能存在的各类污染物进行去除处理，进而将总蛋白质的浓度精准调节至适合进行上样操作的范围之内。值得注意的是，样品制备的质量高低将会对电泳所获得的结果以及后续蛋白免疫印迹数据的最终质量产生极为重大的影响。一、细胞裂解和分集分离为进行有效地细胞裂解，产生可溶形式的目标蛋白，需要考虑以下几... 2025 02-17 内参蛋白即是内部参照蛋白，一般指由管家基因编码表达的蛋白。它们在不同组织和细胞中表达相对稳定，在检测目标蛋白的表达水平变化时常被用来做参照物。 内参抗体是对内参蛋白进行检测的抗体，在Western Blot实验中可以通过检测内参蛋白来矫正蛋白上样量、判断转膜效率、判断蛋白Marker分子量是否正确和显色等实验步骤是否正常，保证实验结果的准确性。常见内参蛋白（1）Actin即肌动蛋白... 2025 02-10 一、实验器材准备：待提取蛋白的细胞，冰盒，96孔板，细胞刮板，裂解液（蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂），PBS，EP管，酶标仪等。二、实验步骤（一）实验样品准备裂解液直接裂解法：1.将全部试剂及耗材放入冰盒箱中预冷。2.将细胞培养瓶或者培养板中的培养液吸出，用已经预冷的PBS 清洗两遍，并用移液枪将PBS吸净，加入裂解液裂解细胞。3.用细胞刮板将培养瓶或者培养板中的细胞轻轻刮下，驱赶到一个角落中... 2025 02-05 1. 使用常规含血清冻存液（培养基+血清+DMSO）时，没有使用程序降温冻存盒或泡沫盒等保温措施。降温过快形成冰晶将导致细胞破裂死亡，常规含血清冻存液需要搭配冻存盒使用。现在市售的程序冻存盒可以确保温度以1℃/min的速度缓慢下降。没有冻存盒的可以将冻存管放在泡沫盒中4℃静置5-10min，再-20℃静置2h后转入-80℃过夜，第二天转入液氮保存。没有冻存盒也没有泡沫盒的，建议用无血清非程序... 2025 01-20 1. 若液氮或冰箱距离水浴锅较远，没有做保冷措施为防止细胞在运输路上开始融化（特别是夏季），冻存细胞需要放在干冰或冰盒上运送至水浴锅。 2. 运输冻存管时手触碰到细胞部分或放在了口袋里请勿用手触碰冻存管身，避免局部温度升高导致细胞开始融化。应捏住管盖或放在容器中运输 3. 采用错误的方式融化细胞不要用手捂化（搓热也不行），手心温度不够高，细胞受热不均匀且降温速度太慢导致细胞死亡。 4. 水浴... 2025 01-13 如何避免细胞培养过程中出现细胞死亡1.无菌操作：维持无菌条件，定期为设备和工作台消毒，并保持实验室环境清洁。2.适宜的的培养条件：严格控制温度、湿度、PH值以及CO2浓度，使之符合细胞生长最佳条件。3.规律更换新鲜培养基：按时更换配方适当、新鲜的培养基以提供必需的营养和维持合适的代谢水平。4.适度密度与传代：观察并保持细胞生长至适宜的密度，并按需进行传代，以避免过度生长引起的营养不足或接触抑... 2025 01-06 细胞铺板实验主要分为3大步骤：收集细胞→细胞计数→细胞接种。一、收集细胞，制作单细胞悬液这里需注意：1.细胞需要选择适用的消化液、适当的消化温度和时间。建议新手或者养的是一个新细胞时，自己要观察最佳胰酶消化时间及浓度。2.消化后需要轻轻拍打细胞贴壁面，震落细胞。2.一般用1000rpm/min离心即可，离心力太大细胞容易抱团！3.离心后，要充分悬浮！悬浮离心后的细胞团时，先不要把所有液体都加... 2024 12-30 一、结果图中没有条带1.原因：一抗二抗加错，或者一抗二抗样本之间不匹配建议：检查一抗和二抗是否加对，选择针对一抗来源的种属的二抗2.原因：一抗浓度偏低或蛋白浓度偏低，未达到检测界限建议：使用新鲜抗体；调整抗体浓度，避免抗体重复使用3.原因：发光液失效或不够灵敏建议：使用新鲜的灵敏型发光液4.原因：转膜不充分或转膜时间过长建议：可以用丽春红染膜确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间... 2024 12-23 细胞培养过程中，通过显微镜观察到细胞表面或间隙中存在大小不一、数量不定、形态各异的颗粒物或絮状物，这些异物有如下可能：一、血清沉淀物血清沉淀物主要包含纤维蛋白（棉絮状沉淀）、脂蛋白、胎球蛋白以及磷酸钙（小黑点状）。其中磷酸钙会让血清变浑浊，镜下观察是一个个小黑点在做布朗运动，常被误认为是微生物污染，这些沉淀物一般不会影响细胞培养。二、黑胶虫污染1.黑胶虫可能在培养基里生存，通常在细胞间隙之间... 2024 12-16 原代细胞的提取方法主要包括：1.机械分离法：通过物理手段将组织分散成单个细胞，适用于分离纤维成分较少的软组织。2.酶解法：利用各种酶，如胰蛋白酶、胶原酶等，将细胞间质分解，细胞分散成单个细胞，是最常用的方法。3.组织块培养法：将小块组织附着于培养器皿，是组织块中的细胞爬出，适用于基质附着型细胞，如成纤维细胞、平滑细胞等特定类型细胞。在实际操作中，选择适当的提取方法取决于组织类型和所需细胞的特... 2024 12-09 支原体检测方法有很多种，最常用的是PCR法、LAMP法（一步法）、酶法，这三种方法简便快捷，特异性高、灵敏度高。除此之外，还有DNA荧光染色法、培养法、电镜观察法、ELISA法等。每种方法各有利弊，科研人员应根据实验需求和实际情况选择合适的检测方法。建议：1.定期对细胞进行支原体检测，早发现早清除，避免支原体影响实验。2.使用两种或两种以上的方法进行检测，结果可信度更高。 2024 12-02 细胞传代后增殖缓慢1. 接种密度低很多细胞都有密度依赖，细胞会分泌一些因子到培养基中促进周围的细胞生长，如果细胞密度太低，这种化学信号的传代减弱，细胞状态受到影响。接种密度越低，增殖越慢，甚至不增殖。根据细胞生长速度确定合适的传代比例和接种密度，如果细胞已经很稀疏了，可以继续培养，也可以将细胞重新传到更小的培养皿中来增加密度2. 培养基、血清不合适细胞更换新的血清和培养基，尤其是没有做梯度替... 2024 11-25 1细胞复苏1.从液氮罐中取出细胞，迅速放置于37℃恒温水浴锅，缓慢摇晃，待完全融化；2.冻存管表面用75%酒精仔细擦拭消毒，转移入无菌操作台；3.细胞悬浮液转移到离心管中，加入37℃预热的DMEM-10%FBS培养基2ml；4.离心5min，转速1000 rpm，吸弃上清液；5.5ml DMEM-10%FBS将细胞重悬，吹匀后转移至细胞培养瓶；6.放入CO2恒温培养箱，37℃，5% CO2培... 2024 11-18 胰蛋白酶可水解细胞间的蛋白质，使组织或贴壁细胞解离成单个细胞，是目前最常用的消化方法。但胰酶消化时间过长，可能会增加细胞的凋亡率。因为过度的消化可能对细胞膜造成损伤，影响细胞表面受体蛋白的功能性和完整性。在细胞消化实际操作中，应依据不同细胞类型的具体特征选择合适的胰酶浓度、消化温度、细致调整消化时间，力求在高效分离细胞的同事，最大限度地保留细胞额活力与健康状态。此外，消化完成后需要及时添加含... |
