WB实验样本

蛋白电泳的样品制备环节涵盖了多个关键步骤，其中包括从细胞基质当中有效地提取出蛋白样品，并使其充分溶解，同时还要对可能存在的各类污染物进行去除处理，进而将总蛋白质的浓度精准调节至适合进行上样操作的范围之内。值得注意的是，样品制备的质量高低将会对电泳所获得的结果以及后续蛋白免疫印迹数据的最终质量产生极为重大的影响。

一、细胞裂解和分集分离

为进行有效地细胞裂解，产生可溶形式的目标蛋白，需要考虑以下几个因素：

1.细胞裂解方法，因为不同的样品类型需要不同的方法才能有效裂解细胞;

2.目标蛋白的亚细胞位置，选择一种能富集该细胞结构的方法;

3.合适的裂解液以释放出足量目标蛋白，缓冲液中的除垢剂会影响某些蛋白的裂

技巧:无论采用何种细胞破碎方法，均应除去所有不溶物，以免堵塞凝胶孔洞。上样前离心(15'C下 20,000 xg，持续15分钟)。

二、常规细胞裂解方法

1.使用除垢剂

除垢剂能够溶解那些易于破裂的细胞，像是血细胞或者组织培养细胞。诸如NP - 40这类的非离子型除垢剂，性质相对温和，不会致使蛋白质变性，但溶解疏水蛋白能力较低。而两性离子除垢剂(例如 CHAPS) 以及离子除垢剂(比如SDS)，它们不仅能够有效提升蛋白的溶解性，还会使蛋白发生变性。

2.机械方法

借助匀浆器、超声波仪或者组织研磨器等工具对细胞施加外力，使其破碎。像超声处理这类方法在操作过程中会产生热量，进而导致样品过热，所以需要采取冷却措施来防止这种情况发生。在进行超声处理期间，将样品浸入冰浴便可满足冷却需求。当使用研钵和研杵研磨样品时，则需要添加液氮以维持样品处于低温状态。通常情况下，为了能够最大限度地将样品中的蛋白质释放出来，会同时采用化学破碎法与机械法相结合的方式。

3.酶处理

运用那些可以对植物或细菌细胞壁进行消化的酶来对细胞实施裂解处理。例如，针对植物细胞可使用纤维素酶和果胶酶;对于酵母细胞可选用裂解酶;而细菌则可使用溶菌酶。在经过酶处理之后，一般还会再运用另外一种破碎方法继续加以处理，比如超声处理。

三、细胞分级

当目标蛋白含量低，或仅存于特定细胞器中，蛋白免疫印迹实验会变得相对困难。在这种情况下，可以采用亚细胞器分级分离来实现最佳检测效果。亚细胞器分级分离可以通过差速离心来完成，也可以通过使用特定的裂解除垢剂来实现。

例如，通过将细胞与非离子型除垢剂（Triton-X或Tween 20）一起孵育，可以将疏水性(膜结合)蛋白与亲水性蛋白(胞质)分离，从而形成两个不同的层，疏水层和亲水层。

通常情况下可使用离心法分离匀浆后的线粒体，细胞核和内质网。如果需要富集特定细胞器，则可以使用细胞分级试剂盒，特别是要检测低表达蛋白时。细胞分级分离过程首先是通过匀浆裂解细胞，开始以较低的速度离心，然后逐渐过渡到较高的离心速度。此过程需要您知道目标蛋白的表达位置，并使用正确的蛋白酶和磷酸酶抑制剂。

四、蛋白质溶解和稳定

为保证电泳成功，必须破坏蛋白质之间的聚集作用。理想情况下，细胞裂解和蛋白的溶解都在电泳样品缓冲液中进行。如果无法做到这一点，则必须在增溶溶液中制备蛋白，该溶液应含有除垢剂、变性剂/还原剂，以及兼容电泳的缓冲液。

裂解缓冲液包含不同的除垢剂，可帮助破坏细胞并释放蛋白，从而使它们溶于溶液。但是，每种蛋白质都是不同的，它们与缓冲液和除垢剂的反应可能不一样。如果目标蛋白没有在溶液中溶解，或者蛋白-蛋白相互作用比较特殊，则需要尝试使用其他特殊缓冲液，并交换去除除垢剂。

一般原则：

1.全细胞烈解物和膜结合蛋白-最常用的缓冲液是RIPA 和 NP-40。RIPA缓冲液的强力特性适合难溶蛋自。

2.核/线粒体蛋白-首选RIPA。但是，通常首先使用分级分离方案来增加特定细胞器及目标蛋白的浓度。

3.细胞质蛋白- Tris-HC|有时比 RIPA缓冲液更有优势。需要实验测试确定最佳条件，以获取更多的目标蛋白。

4.天然状态蛋白质- CHAPS 是两性离子除垢剂，特别适合保护蛋白的天然状态。常用于等电聚焦(IEF )和2-D电泳。

5.核/线粒体蛋白-首选RIPA。然而，分级方案通常首先用于增加目标蛋白所在细胞器的浓度。

五、蛋白质稳定化

细胞裂解后，由于细胞内酶活性的存在，蛋白质会开始发生水解、去磷酸化及变性。在冰上或4"C下制备样品，加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂等方法可将酶活性降至最低，裂解缓冲液应在使用前新鲜制备。

可使用市场上的即用型混合抑制剂(专有配方)，也可以根据个人需要自制混合缓冲液下表列出了常见的蛋白酶/磷酸酶抑制剂，它们的靶标以及建议的在裂解缓冲液中的终浓度。

六、蛋白样品定量

在电泳上样前，需要知道每个样品中总蛋白浓度，以确保适当的蛋白上样量，避免凝胶过载。此外，还需要保证每个泳道上样量接近，以确保在相同的基础上比较不同样品的目标蛋白表达水平。

测量蛋白浓度的最常用方法是检测280nm或者205nm处的吸光度。另外还有几种其他测定方法，如Bradford，依赖于肽键的金属离子还原反应;如Lowy 和BCA测定法，通过染料结合或还原反应。以上几种定量方法都基于类似的理论基础，即产生与样品中蛋白质量成正比的颜色变化。通过将目标样品与已知标准系列(通常为裂解液中稀释的牛血清白蛋白进行比较来确定蛋白浓度。为了获得准确的蛋白浓度测量值，最好测试一些样品稀释液以确保结果在测定的线性范围内。

七、上样缓冲液

确定蛋白浓度后，将样品在凝胶上样缓冲液(通常为 Laemm缓冲液)中稀释。该缓冲液含有甘油，从而使溶液比凝胶电泳缓冲液黏稠，样品容易沉入凝胶上样孔中。上样缓冲液还包含跟踪染料(溴酚蓝)，该染料也会在凝胶中迁移，指示电泳迁移距离，显示电泳进展情况。

将样品在上样/样品缓冲液中100 C加热5分钟，或70・C加热10分钟以帮助蛋白变性。变性后的蛋白样品可放置在室温，以备电泳上样:如样品不需要立即电泳上样，也可置于4°C或 -20*C长时间保存。

样品缓冲液配置技巧：

(1)防止降解

在对离心混合物进行处理之后，您应当添加裂解缓冲液以及混合蛋白酶抑制剂。或许您需要采用不同浓度的混合蛋白酶抑制剂来重复这一操作流程，以此获取足够高的蛋白浓度。

(2)定量样品

对样品中的总蛋白含量予以定量，能够确保在进行电泳上样时各个样品的量是均等的。当需要对不同泳道中的目标蛋白进行量化分析时(比如在对比对照细胞和经过实验处理的细胞之间的情况时)，这一点显得尤为重要。相等的上样量可以使在后续分析过程中归一化因子的变化幅度更小。

(3)电泳前去除不溶物

在细胞破裂之后，需在15 C的条件下，以20,000xg的离心速度进行离心操作，持续时间为15分钟，借此来除去所有的不溶物。固体颗粒有可能会堵塞凝胶的孔洞，从而影响电泳效果。