WB条带问题

一、结果图中没有条带

1.原因：一抗二抗加错，或者一抗二抗样本之间不匹配

建议：检查一抗和二抗是否加对，选择针对一抗来源的种属的二抗

2.原因：一抗浓度偏低或蛋白浓度偏低，未达到检测界限

建议：使用新鲜抗体；调整抗体浓度，避免抗体重复使用

3.原因：发光液失效或不够灵敏

建议：使用新鲜的灵敏型发光液

4.原因：转膜不充分或转膜时间过长

建议：可以用丽春红染膜确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流

5.原因：过度封闭或者过度洗脱

建议：减少封闭时间；减少洗膜时间，降低去垢剂浓度，建议使用不高于0.1%的温和去垢剂 Tween-20

6.原因：蛋白降解

建议：提取蛋白样本时加入蛋白酶抑制剂；处理样本时在冰上操作

二、结果图中有较多非特异性条带

1.原因：蛋白降解

建议：加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。

2.原因：抗体特异性不高

建议：重新选择或制备高特异性的抗体。

3.原因：未封闭或者封闭液条件（时间、温度、成分等）有问题

建议：重新调整封闭条件；选择更加适合的封闭液

4.原因：上样量过高

建议：适当减少上样量。

5.原因：蛋白有聚合体，如二聚体、四聚体和多聚体

建议：电泳上样前，煮沸蛋白样本，使蛋白质解聚

6.原因：目的蛋白具有多种修饰形式，如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等

建议：查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小

7.原因：细胞传代次数过多，其蛋白表达模式发生分化

建议：使用原代细胞株，和待测的细胞样本一起做对照实验

8.原因：目的蛋白有多个亚型，分子量都不同

建议：查阅文献，熟悉目的蛋白的信息

三、结果图中背景较高

1.原因：未进行封闭或封闭不充分

建议：延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液

2.原因：一抗或二抗与封闭剂有交叉反应

建议：①在孵育和洗涤液中加入温和去污剂如Tween-20。②脱脂奶粉含有的酪蛋白是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。③使用 BSA 代替奶粉作为封闭剂

3.原因：实验过程出现了干膜

建议：选择专用的抗体孵育盒，避免液体蒸发，保持膜的湿润

4.原因：膜的选择导致的高背景

建议：用NC 膜替换PVDF 膜

5.原因：一抗/二抗浓度过高

建议：调整一抗/二抗浓度，选择适合的抗体稀释度

6.原因：二抗孵育时间过长，或孵育温度过高

建议：适当减少孵育时间；4℃过夜孵育

7.原因：洗膜次数不够

建议：增加洗膜次数

四、结果图中条带位置与抗体说明书不一致

1.原因：蛋白降解

建议：加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作

2.原因：误将杂带当作目的条带

建议：查阅文献，熟悉目的蛋白的信息

3.原因：抗体形成了二聚体或者聚合体

建议：购买抗体前认真阅读抗体说明书，了解抗体的相关信息；换抗体

4.原因：蛋白有聚合体，如二聚体、四聚体和多聚体

建议：电泳上样前，煮沸蛋白样本，使蛋白质解聚

五、结果图中条带反白

1原因：一抗浓度过高，导致底物消耗过快

建议：稀释一抗的浓度

2.原因：化学发光液灵敏度太高

建议：减少曝光时间或选择合适的化学发光液

六、结果图中条带扭曲，拖尾

1.原因：插电泳梳子时，电泳梳子形成的泳道不平整

建议：用上样针拨正泳道

2.原因：缓冲液离子强度不对

建议：根据实验目的，选择适当浓度的缓冲液TBS或PBS

3.原因：凝胶制备不均一

建议：选择胶浓度固定的制备试剂盒

4.原因：浓缩胶电压偏高，导致浓缩效果不太好

建议：降低电泳电压

5.原因：上样量过大或样本浓度过高

建议：适当减少上样量；稀释样本

6.原因：样本里有不溶性颗粒或者核酸污染

建议：制备样本时离心要充分，去除杂质；实验所用的器材需洁净

七、结果图中条带不完整

1.原因：转印耗材或仪器质量不好

建议：选择合适的转印仪、转膜海绵和滤纸

2.原因：抗体孵育不均一，或未充分结合

建议：增加抗体孵育时间，建议4℃过夜孵育

3.原因：抗体浓度偏低

建议：使用高浓度抗体

4.原因：化学发光液未加均一

建议：适当增加化学发光液的量

5.原因：反应时间不够

建议：增加化学发光显色反应的时间

八、结果图背景有黑色斑点或者白点

1.原因：封闭液里面有不溶性颗粒

建议：使用新鲜的封闭液

2.原因：转膜时膜与胶之间有气泡

建议：转膜时将PVDF膜慢慢贴胶上后，可以用玻璃棒轻轻滚动，以驱赶膜与浇之间的气泡

3.原因：二抗中不溶性颗粒吸附在膜上

建议：使用新鲜的二抗

4.原因：膜被污染

建议：实验操作人员戴手套和口罩，穿实验服，保持膜的干净。禁止用手直接触摸膜