产品编号：YH0009
产品描述：
本试剂盒应用于免疫印迹实验，以化学发光法检测蛋白质。其原理是以辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体直接或间接结合膜上的目的蛋白质，在洗膜后加入本试剂盒配制的ECL工作液，即可由HRP催化发出荧光。
本产品对抗原的最低检测限可达到中飞克级，在western blot实验中，一抗（1 mg/mL）储存液可稀释1:1,000至1:50,000倍，二抗（1mg/mL）储存液可稀释1:50,000至1:200,000倍。发光信号持久，结果可以通过X光胶片曝光或者其他适当荧光成像设备进行检测。
产品优势：
1. 灵敏度高，可检测中飞克级抗原。
2. 信噪比高，条带清晰。
3. 抗猝灭能力强，可重复曝光。
4. 节省抗体，降低成本。
操作指南：
1. 进行常规Western Blot实验。
2. 按照1:1的比例等体积混合适量A液和B液制备ECL工作液。
注：ECL工作液最好在临近使用前配制，推荐使用剂量：0.1ml工作液/cm2膜。
3. 用镊子取出洗好的膜，沥干膜上洗膜液，将结合有蛋白的一面朝上，放置于洁净保鲜膜上。
4. 加上配好的ECL工作液，孵育时确保工作液覆盖整张膜，室温孵育1-2min。
5. 弃去印迹膜上ECL工作液，将一张洁净的保鲜膜平整的铺在印迹膜上。
6. 将处理好的印迹膜置于X光片盒中，在暗室中取一张胶片小心置于膜上，曝光时间取决于膜上的发光强度，曝光后立即显影定影，或将印迹膜放置到荧光成像仪内，按仪器说明书进行检测。
注意事项
1. 本公司ECL试剂盒灵敏度高，需要优化好上样量、一抗、二抗浓度和稀释液、印迹膜及封闭试剂，并按照蛋白表达丰度，参考推荐的抗体稀释比例，来获得最佳实验结果。
2. 如果印迹膜上条带过亮时，建议使用我公司生产的膜再生液去除抗体后重新封闭孵育，并提高一抗二抗稀释比例。如果条带过暗也可将二抗稀释比例降低至1:5000至1:10,000倍，以达到最佳效果。
3. 本试剂盒A液和B液不可以相互污染，否则会降低产品的使用效果。
4. 发光强度会随时间缓慢减弱，建议在两小时内完成实验。
5. 孵育二抗后，洗膜缓冲液应避免使用叠氮钠，叠氮钠是HPR的抑制剂。
6. 为了您的安全和健康，请穿戴实验服并戴一次性手套操作。
常见问题解决方案
遇到的问题 | 原因分析 | 推荐解决方法 |
胶片出现反影 | 反应系统中HRP量过多 | 稀释HRP标记物 |
膜上出现棕色或 黄色条带 |
暗室中观察到强烈发光 |
条带有空斑 |
发光信号持续时间短 | 保鲜膜、显影液或定影液污染 | 养成良好的实验习惯 |
反应系统中HRP量过少 | 增加HRP标记物 |
胶片无条带显现或者信号较弱 | 转膜的效率低 | 提高转膜效率，用预染Marker判断。 |
抗原、抗体量少或不匹配 | 增加抗原/抗体量或选择合适抗原/抗体 |
X光胶片有问题 | 曝光后X光谱全黑（而非透明色），则表明胶片已完全曝光，使用新的X光片 |
显影/定影液有问题 | 可预先曝光一张胶片进行判断，如有问题当换用新的显影/定影液 |
高背景 | 反应系统中HRP量过多 | 稀释HRP标记物，延长封闭时间 |
抗体未清洗干净 | 增加洗膜次数 |
封闭不完全 | 优化封闭条件 |
使用错误的封闭剂 | 使用其他的封闭剂 |
过度曝光 | 降低曝光时间 |
非特异性条带 | 一抗用量过多或者特异性较差 | 减少一抗稀释比例或者更换一抗 |
SDS引起蛋白非特异性结合 | 实验流程中避免使用SDS |
