产品编号： YH0038-1 规格：1 mL
YH0038-2 规格：5×1 mL
产品内容：
2 x qPCR SYBR Green Master Mix(抗体法，No Rox ) | 1 mL | 5×1 mL |
Nuclease-free water | 1 mL | 5×1 mL |
说明书 | 1份 | 1份 |
产品优势：
热启动酶以及优化的缓冲体系，使实时荧光定量PCR具有更高的特异性和灵敏度。
产品简介：
2 x qPCR SYBR Green Master Mix(抗体法，No Rox)是实时荧光定量PCR的预混合溶液，采用SYBR Green I染料法，仅需要加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，减少操作步骤，降低污染几率。产品中包含热启动Taq DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTP、Mg2+。本品中的热启动Taq酶是采用抗体封闭法，经qPCR反应程序中的预变性阶段后即可释放Taq DNA Polymerase酶活，可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增，同时配以针对染料法qPCR优化的Buffer，使实时荧光定量PCR具有更高的特异性和灵敏度。
产品应用
本产品适用于DNA样本的扩增定量，样本类型可以是基因组DNA、cDNA、质粒DNA、λDNA。
适用机型
High Rox适用机型：
ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus;
Low Rox 适用机型：
ABI 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio6,7,12k Flex; Stratagene MX3000P, MX3005P, MX4000P;
不需要Rox校正的仪器型号：
Bio-Rad CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;
Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;
Roche Applied Science LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;
Thermo Scientific PikoReal Cycler;
Cepheid SmartCycler; Illumina Eco qPCR.
运输与保存方法：
-20℃避光保存。≤ 0℃避光运输。有效期18个月。
实验流程
PCR反应体系
组分 | 体积（20 μL） |
2 x qPCR SYBR Green Master Mix(抗体法，No Rox ) | 10 μL |
模板DNA | optional |
引物1(10 μM) | 0.4 μL |
引物2(10 μM) | 0.4 μL |
Nuclease-free water | to 20 μL |
【注】：
1）引物浓度：一般来说引物终浓度为0.2μM，也可以根据反应情况在0.1-1.0μM范围内进行调整。
2）模板用量：qPCR灵敏度极高，反应体系中模板用量对最终检测结果会有很大影响。建议将模板稀释后再加入反应体系中，如有必要可进行梯度稀释，确定最适的模板浓度，最佳模板用量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。如模板为cDNA原液，使用体积不应超过qPCR总体积的1/10。
3）由于本品检测灵敏度极高，为避免交叉污染和气溶胶污染，请于超净工作台内配制，并使用带滤芯的无核酸酶的枪头以及反应管。
4）本品中含有荧光染料SYBR Green I，因此需避光保存，配制反应体系时应尽量避免强光照射。
5）使用前解冻Master Mix并轻轻上下颠倒混匀，混匀后经短暂离心即可使用。如每次使用量小，可进行分装，避免反复冻融和剧烈涡旋，以免造成酶活下降。
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 95℃ | 1 min | 1 |
变性 | 95℃ | 10 sec | 40-45 |
退火/延伸 | 60℃ | 30 sec |
熔解曲线 | 仪器默认设置 | 1 |
按下列条件进行qPCR反应
【注】：
1）该预变性条件适用于大多数扩增反应，可根据模板和引物的具体情况适当延长预变性时间。
2）退火/延伸的温度及时间可根据引物和目的基因的长度进行调整。
3）熔解曲线：通常情况下使用仪器默认熔解曲线程序即可。
常见问题：
1）无扩增曲线出现
①确认反应程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增效率程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序中将信号采集设置在延伸阶段。
②模板降解，重新制备模板，重复实验。
③体系中存在PCR抑制剂，一般为模板带入，加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。
2）熔解曲线出现多峰
①可通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。
②若为引物二聚体，可适当降低引物浓度，或重新设计扩增效率高的引物。
③如模板为cDNA，出现熔解曲线多峰，说明模板中带有基因组污染，需重新制备cDNA模板。
3）阴性对照出现明显扩增
①反应体系污染：更换新的Master Mix、水、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制，并使用带滤芯的枪头，减少气溶胶污染。
②配合熔解曲线分析，出现的扩增曲线是否为引物二聚体。
4）扩增曲线性状异常
①个别扩增曲线出现突然骤降：反应管内有气泡残留，处理样本时要注意离心，避免反应管内有气泡残留。
②扩增曲线不光滑：模板浓度低，信号弱。提高模板浓度重复实验。
