Caspase 1 活细胞凋亡检测试剂（绿色）

产品描述：

活细胞凋亡检测试剂盒基于半胱天冬酶的荧光抑制剂。这些抑制剂具有细胞渗透性和非细胞毒性。一旦进入细胞，半胱天冬酶抑制剂与活性半胱天冬酶共价结合。Caspase-1主要参与促炎细胞因子的激活和细胞凋亡过程。已经证明胱天蛋白酶1对肽序列Tyr-Val-Ala-Asp（YVAD）具有底物选择性。该试剂盒使用 FAM-YVAD-FMK作为半胱天冬酶1活性的荧光指示剂。FAM-YVAD-FMK在凋亡细胞中不可逆地结合活化的半胱天冬酶1。一旦与半胱天冬酶1结合，荧光试剂保留在细胞内。结合抑制胱天蛋白酶1但不会阻止细胞凋亡的进行，有多种参数可用于监测细胞凋亡。

产品优势：

本试剂盒旨在通过测量活细胞中的caspase1活化来检测细胞凋亡。它用于定量凋亡细胞中活化的半胱天冬酶1活性，或用于筛选半胱天冬酶1抑制剂。绿色标记试剂FAM-YVAD-FMK允许通过荧光显微镜，流式细胞仪或荧光酶标仪直接检测凋亡细胞中活化的半胱天冬酶1。本试剂盒为所有必需组分提供优化的分析方案。

技术资料：
1.Ex(nm)：493    2.Em(nm)：517

订购信息：

产品组分：

运输与保存：

蓝冰运输。-20℃保存，有效期12个月。

实验方案：
1.用密度为5×105到2×106个细胞/mL的测试化合物制备细胞。 2.将FAM-YVAD-FMK以1：150的比例加入到细胞溶液中。
3在室温下孵育1h。
4.将细胞沉淀，用缓冲液或生长培养基洗涤并重悬细胞。
5.在Ex/Em=490/525nm处分析细胞。
【注】：使用前将所有部件在室温下解冻。

操作步骤：
1.根据您的特异性诱导方案，将细胞培养至最适于细胞凋亡诱导的密度，但不超过2x106个细胞/mL。同时，对于每种标记条件，以与诱导群体相同的密度培养非诱导的阴性对照细胞群。以下是一些诱导悬浮培
养细胞凋亡的例子：

（1）用2μg/ml喜树碱处理Jurkat细胞3h。

（2）用1μM星形孢菌素处理Jurkat细胞3h。

（3）用4μg/ml喜树碱处理HL-60细胞4h。

（4）用1μM星形孢菌素处理HL-60细胞4h。
【注】：应对每个细胞系进行单独评估，以确定诱导细胞凋亡的最佳细胞密度。
2.通过向FAM-YVAD-FMK（组分A）的小瓶中加入50μLDMSO制备150XFAM-YVAD-FMKDMSO储备溶液。
3.将150×FAM-YVAD-FMKDMSO储备溶液（来自步骤1）以1：150的比例添加到细胞溶液中，并将细
胞在37℃，5％CO2培养箱中孵育1h。
【注1】：对于FAM-YVAD-FMK标记，细胞可以浓缩至~5×106个细胞/mL。未使用的150X
FAM-YVAD-FMKDMSO储备溶液应分为单次使用的等分试样并储存在-20℃。
【注2】：对于粘附细胞，用0.5mMEDTA轻轻提起细胞以保持细胞完整，并在用FAM-YVAD-FMK孵育之前用含血清的培养基洗涤细胞一次。
【注3】：适当的孵育时间取决于所用的细胞类型和细胞浓度。优化每个实验的孵育时间。
4.将细胞以约200g旋转5min，并用1mL洗涤缓冲液（组分B）洗涤细胞2次。将细胞重悬于所需量的洗涤缓冲液中。

【注1】：FAM-YVAD-FMK是荧光的，因此清除任何未结合的试剂以消除背景非常重要。
【注2】：对于分离的细胞，应将细胞浓度调节至每个微量滴定板孔中2-5×105个细胞/100μL等分试样，用于步骤6。
5.如果需要，用DNA染色标记细胞（如用于死细胞的碘化丙锭，或用于细胞核染色的整个群体的Hoechst）。 6.通过荧光显微镜，流式细胞仪或荧光酶标仪在Ex/Em=490/525nm处检测荧光强度（对于碘化丙锭，Ex /Em=535/635nm;对于Hoechst染料，Ex/Em=350/461纳米）。
（1）对于流式细胞仪，使用FL1通道监测荧光强度（FL2通道用于碘化丙锭染色）。
（2）用于荧光显微镜和荧光酶标仪。将100μL细胞悬浮液置于96孔黑壁/微量滴定板透明底部的每个孔中。【注】：如果需要平衡细胞浓度，调整诱导细胞的悬浮体积以接近非诱导细胞群的细胞密度。如果您的细
胞治疗不会导致受刺激细胞群数量的显着损失，则此调整步骤是可选的。
（3）使用FITC通道在荧光显微镜下观察细胞（用于碘化丙啶染色的TRITC通道，用于Hoechst染色的DAPI 通道）。
（4）使用荧光酶标仪，使用Ex/Em=490/525nm（在515nm处截止）底部读取模式监测荧光强度。

注意事项：
1.本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。

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