双荧光素酶报告基因检测试剂盒使用说明
（高敏型）
产品型号：YM0002-2
产品规格：100T
产品说明：
报告基因检测常用于研究真核生物基因表达调控，萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶可以分别催化底物萤光素(luciferin)和腔肠素(coelenterazine)发出生物萤光(bioluminescence)，这种发光反应具有良好的光学特征和浓度线性范围，同时检测的灵敏度高，可达到10-20mol。两种催化反应最适浓度不同，因此互不干扰，配合使用形成一套高灵敏的双荧光素酶报告基因检测系统，其中海肾萤光素酶常作为内参照。
萤火虫萤光素酶是一种分子量约为61 kDa的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，催化luciferin氧化成 oxyluciferin，在此过程中会产生发射波长560 nm的生物萤光。海肾萤光素酶是一种分子量约为36 kDa的蛋白，在氧气存在条件下，催化腔肠素(Coelenterazine)氧化成coelenteramide，在此过程中会发出波长约为480 nm的生物萤光。在后加入海肾萤光素酶底物时，可有效淬灭萤火虫荧光素酶催化 luciferin 的发光，而不干扰海肾萤光素酶的活性，从而实现双萤光素酶报告基因检测。生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer)或)或多功能酶标仪进行测定。通过萤光素酶与其底物催化发光的体系，可以高效、灵敏地检测目的基因的表达。检测原理如图所示：
图1.荧光素酶报告基因反应原理图
试剂盒组分：
名称 | 规格 | 保存条件 |
5x Universal lysis Buffer（ULB） | 20 mL | -20℃ |
Fluc Buffer A | 5 mL | -20℃ |
Fluc substrate | 干粉 | -20℃ |
Rluc Buffer B | 5 mL | -20℃ |
50x Rluc substrate | 100 μL | -20℃ |
保存运输条件：冰袋运输，-20℃保存6个月，-80℃保存1年以上。
操作步骤：
1. 试剂准备：
（1）1x Universal lysis Buffer配置：取所需体积的5x Universal lysis Buffer临用前用三蒸水稀释至1x用；
（2）Fluc buffer A 工作液：试剂盒首次启用时，将Fluc buffer A全部加入到Fluc substrate中，适当吹打摇匀至粉末完全溶解后分装到棕色管中-20℃保存备用；
（3）Rluc Buffer B工作液：临用前取50x Rluc substrate用Rluc Buffer B稀释至1x用（按需配置），配置好的Rluc Buffer B工作液在2-3 h内使用有效。（试剂配置过程中注意避光）
2. 细胞裂解物制备:
弃去培养板中的培养液，加入足量PBS清洗一遍，细胞刮刮取收集沉淀(如为悬浮细胞直接离心弃上清收集沉淀)。细胞沉淀可-80℃保存，也可立即加入适量1x Universal lysis Buffer吹打混匀，液氮冻融三次，制备细胞裂解物。
细胞裂解液推荐使用量：
细胞培养板 | 24孔板 | 12孔板 | 6孔板 |
1x Universal lysis Buffer（ULB） | 40 μL | 60 μL | 100μL |
3. 萤光数值检测：
（1）荧光酶标仪设定， 选择生物发光检测功能，根据本批样本的灵敏度选择合适增益与积分时间，默认为增益135，积分时间10 s。
（2）检测：
1) 移液枪吸取细胞裂解液20 μL到黑色孔板底部（充分混匀裂解物）；
2) 加入100 μL Fluc buffer A，移液器轻柔快速吹打混匀三次，立即启动检测，记录发光值（F值）；
3)加入100 μL Rluc buffer B，移液器轻柔快速吹打混匀三次，立即启动检测，记录发光值（R值）。
（因手动控制检测会导致时间误差较大，对结果有一定的影响，建议配备计时器，保证不同样本之间反应和检测时长基本一致)
4.数据分析：
（1）实验设计：根据实验目的，每组实验均应设置空白对照组，对照组和处理组。
a.空白对照组
背景F：未转染细胞裂解液+ Fluc buffer A。
背景R：未转染细胞裂解液+ Fluc buffer A + Rluc buffer B。
注：空白对照组样品量须与实验样品量相同，且与实验样品含有相同的培养基/血清组合。
b. 对照组：转染细胞未经实验因素处理 (即对照组F和对照组R)。
c. 实验组：转染细胞经实验化合物处理(即实验组F和实验组R)。
计算结果：对照组比值=(对照组F-背景F)/(对照组R-背景R)，
实验组比值=(实验组F-背景F）/(实验组R-背景R)。
表达倍数=实验组比值/对照组比值。
5.注意事项:
（1）反应温度：酶促反应对温度较为敏感，加样检测前务必将检测试剂以及细胞培养液平衡至室温（20-25℃）。
（2）检测仪器：能检测化学发光的仪器都适用，但由于不同仪器的设置和灵敏度不同，测得的光信号值也会不同。
检测板：为防止孔间干扰，推荐使用不透光酶标板。
（3）发光信号会受到检测环境如培养基组分、温度等影响，应确保同组内不同样本检测条件一致。
（4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套。
（5）本产品仅作科研用途！
图2.荧光素酶报告基因检测试剂盒操作示意图
6. 实验范例：
在六孔板中接种适量细胞过夜至贴壁状态，第二天用新鲜的空白培养基饥饿细胞4h后共转三个质粒：1.含有法尼醇X受体（FXR）启动子区的荧光素酶报告基因表达载体质粒；2.含有FXR启动子区转录因子E2功能区的表达载体质粒；3.海参荧光素酶重组表达载体质粒。转染6h后更换为含有不同药物浓度的鹅去氧胆酸（Chenodeoxycholic acid，CDCA）和奥贝胆酸（Ocaliva，OCA）和完全培养液培养细胞48h，最后按试剂盒说明书操作刮收沉淀，随后立即裂解进行荧光素酶报告基因活性检测，结果如下:
图3.（左）两个浓度（10μM，20 μM）CDCA药物处理下，FXR启动子区荧光素酶报告基因激动倍数图；（右）两个浓度（10μM，20 μM）OCA药物处理下，FXR启动子区荧光素酶报告基因激动倍数图（红色：云贺生物品牌产品测定结果；黄色：进口“P”品牌产品测定结果）。
